抗體Fc區(qū)域的糖基化改造

單抗Asn297處的糖基化模式調(diào)節(jié)了抗體Fc結(jié)構(gòu)域與Fc受體結(jié)合的構(gòu)象狀態(tài)。 這些N-聚糖對(duì)FcγR結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)完整性至關(guān)重要，已經(jīng)證明糖基化的去除消除了FcγR親和力和補(bǔ)體結(jié)合/效應(yīng)功能。目前已經(jīng)證實(shí)減少巖藻糖和唾液酸基團(tuán)并增加二等分N-乙酰葡糖胺，半乳糖和甘露糖可增強(qiáng)Fc介導(dǎo)的ADCC和CDC效應(yīng)。

下面我們來看幾個(gè)臨床上成功的例子。

mogamulizumab是一種靶向CC趨化因子受體4型（CCR4）的人源化單克隆抗體，被FDA批準(zhǔn)用于復(fù)發(fā)或難治性CCR4陽(yáng)性T細(xì)胞白血病或淋巴瘤的患者的治療。obinutuzumab（GA101，Gazyva），是一種含有N-乙酰葡糖胺的非巖藻糖基化抗CD20單抗藥物，Obinutuzumab于2013年被批準(zhǔn)用于治療先前未治療的慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）患者。

與第一代產(chǎn)品利妥昔單抗（美羅華）相比，第二代產(chǎn)品obinutuzumab去除了50%的鹽藻糖修飾并包含二等分N-乙酰葡糖胺，對(duì)人FcγRIII的親和力較第一代產(chǎn)品高50倍，其對(duì)表達(dá)CD20的淋巴瘤細(xì)胞系的ADCC效應(yīng)增加了10-100倍，在臨床上也體現(xiàn)了治療的優(yōu)越性。

目前國(guó)內(nèi)天廣實(shí)開發(fā)了第3代產(chǎn)品MIL62，MIL62是利妥昔單抗（美羅華）與阿托珠單抗（GA101）的優(yōu)效產(chǎn)品（me-better）。MIL62是100%巖藻糖敲除的第三代CD20抗體，目前體外藥效學(xué)證明有效于進(jìn)口產(chǎn)品美羅華。

第三個(gè)例子是benralizumab（Fasenra），該抗體是人源化的非巖藻糖基化的抗IL-5Rα抗體，其介導(dǎo)與表達(dá)IL-5Rα的嗜酸性粒細(xì)胞的ADCC消耗效應(yīng)顯著，所述嗜酸性粒細(xì)胞涉及哮喘急性發(fā)作。Reed等人通過臨床研究發(fā)現(xiàn)通過單次靜脈注射benralizumab（MEDI-563）就可以導(dǎo)致輕度哮喘患者嗜酸性粒細(xì)胞的強(qiáng)烈消耗，效果可以持續(xù)8-12周。

抗體Fc區(qū)域的氨基酸突變改造

通過于抗體Fc結(jié)構(gòu)域中引入氨基酸的點(diǎn)突變可以增強(qiáng)抗體Fc效應(yīng)功能。該方法不僅僅限于對(duì)FcγRIII的改變，還允許突變Fc結(jié)構(gòu)域中與多個(gè)活化FcγR有關(guān)的區(qū)域。

一系列已上市治療性單抗藥物（利妥昔單抗，西妥昔單抗，曲妥珠單抗和阿侖單抗）的Fc區(qū)域的突變體顯示出FcγRIIIA親和力的增加及FcγRIIB親和力的降低，這些抗體Fc區(qū)域的雙突變體（Ser239Asp / Ile332Glu）和三聯(lián)突變體（Ser239Asp / Ile332Glu / Ala330Leu）增強(qiáng)了ADCC活性。 這些突變體在臨床前體外實(shí)驗(yàn)中顯示出2個(gè)數(shù)量級(jí)的體外效應(yīng)功能增強(qiáng)，能夠作用于表達(dá)低水平靶抗原的細(xì)胞，并在體內(nèi)臨床前模型中顯示出細(xì)胞毒性效力的增強(qiáng)，當(dāng)然這些突變體的臨床療效還需要進(jìn)一步證實(shí)。

幾項(xiàng)臨床前研究同樣也表明Fc蛋白工程化單克隆抗體對(duì)癌癥和病毒的體內(nèi)活性增強(qiáng)，目前這些單克隆抗體已進(jìn)入臨床開發(fā)階段，例如治療白血病的CD19抗體 Xmab5574（MOR00208），用于治療乳腺癌的HER2抗體margetuximab。

此外我們還可以突變抗體Fc片段的Gly236Ala以增強(qiáng)抗體藥物的ADCP活性，其選擇性地增強(qiáng)對(duì)FcγRIIA的親和力，通過Gly236Ala突變（巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的ADCP和NK細(xì)胞介導(dǎo)的ADCC）以及Ser239Asp / Ile332Glu雙突變的聯(lián)合（ADCC增強(qiáng)）進(jìn)一步增強(qiáng)抗體的效應(yīng)功能。

此外，位于上鉸鏈區(qū)的突變可以增強(qiáng)與C1q的結(jié)合以增強(qiáng)抗體的CDC活性。其他位置的點(diǎn)突變，如CH2結(jié)構(gòu)域中的Lys326Trp和Glu333Ala，已被證明可以增強(qiáng)CDC效應(yīng)。 雙突變體，如Lys326Trp / Glu333Ala，Lys326Ala / Glu333Ala和Lys326Met / Glu333Ser，以及三重突變體，如Ser267Glu / His268Phe / Ser324Thr，與單個(gè)突變相比，其抗體的CDC效應(yīng)進(jìn)一步增加。

設(shè)計(jì)新功能抗體

新功能抗體藥物是當(dāng)前及未來抗體藥物開發(fā)的一個(gè)重要方向，通過開發(fā)新功能抗體來提高抗體藥物的療效，新功能抗體主要有抗體偶聯(lián)藥物（ADC），雙特異性抗體，納米抗體，F(xiàn)ab片段，ScFv結(jié)構(gòu)的抗體，抗體融合蛋白等。這些抗體的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)大家從很多公開資料中都能了解，這里就不再詳細(xì)闡述。簡(jiǎn)而言之，開發(fā)這些抗體的最終目的還是希望提高抗體藥物的效應(yīng)功能，使抗體藥物的臨床療效提升或副作用改善從而實(shí)現(xiàn)較已有藥物差異化的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

為了實(shí)現(xiàn)上述目標(biāo)，我們應(yīng)從哪些方面去努力呢？總的來看有兩個(gè)重要的方面：

（1）首先應(yīng)該進(jìn)行詳細(xì)和充分的文獻(xiàn)、專利調(diào)研，仔細(xì)分析研究目標(biāo)抗體及對(duì)應(yīng)靶標(biāo)涉及到的全部文獻(xiàn)及專利材料，例如目前針對(duì)這一抗體及作用靶點(diǎn)已經(jīng)開展了哪些研究，哪些方面是未研究的，為什么沒有相關(guān)的研究，在針對(duì)該靶點(diǎn)的抗體藥物設(shè)計(jì)方面哪些是可以近一步改進(jìn)和提高的，以及這些改進(jìn)和提高對(duì)于提高臨床療效及減少副作用的關(guān)系有多大，對(duì)于以上方面的理解深度將會(huì)影響抗體藥物的后續(xù)開發(fā)，要出色的完成上述工作對(duì)于相關(guān)人員的知識(shí)儲(chǔ)備和經(jīng)驗(yàn)的積累也具有很高的要求;

（2）要求抗體藥物研發(fā)人員對(duì)抗體整體及各部分的結(jié)構(gòu)功能有很深的理解，此外還需要對(duì)不同類型的IgG抗體的結(jié)構(gòu)有清晰的認(rèn)識(shí)，清楚的明白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域中每一個(gè)氨基酸的變化對(duì)于抗體結(jié)構(gòu)和功能的影響，并能綜合運(yùn)用現(xiàn)有的各種方法手段進(jìn)行分析驗(yàn)證。在上述基礎(chǔ)上用多種不同的體內(nèi)外模型對(duì)相關(guān)設(shè)計(jì)進(jìn)行多次重復(fù)驗(yàn)證，此外抗體各部分連接的氨基酸也很重要，連接linker的穩(wěn)定性，連接序列的剛性及柔性的組合策略，不同氨基酸的搭配組合，充分考慮所用氨基酸的電荷性質(zhì)等等。做到上述這些方面，往往會(huì)使我們?cè)O(shè)計(jì)的抗體在療效上體現(xiàn)出一個(gè)意想不到的提升效果。

以上我們用較大的篇幅分析了抗體藥物研發(fā)的第一方面的重要變化：抗體藥物的副作用及功能和療效的提升方面。

下邊我們看看文章開篇提到的第二個(gè)方面：?jiǎn)慰顾幬镒饔冒袠?biāo)不斷擴(kuò)大已拓展到新的疾病治療領(lǐng)域和新的適應(yīng)癥。

抗體藥物的靶標(biāo)可以分為已經(jīng)成藥的靶標(biāo)和未成藥的靶標(biāo)，對(duì)于已經(jīng)成藥的靶點(diǎn)來說，由于有大量的科學(xué)和臨床研究，而且有已經(jīng)上市的藥物，對(duì)于作用于這類靶點(diǎn)的抗體，臨床開發(fā)研究的風(fēng)險(xiǎn)較小，我們可以認(rèn)為靶標(biāo)的生物學(xué)風(fēng)險(xiǎn)基本已經(jīng)去除，但對(duì)于開發(fā)針對(duì)此類靶點(diǎn)的抗體藥物來說，后期商業(yè)化的風(fēng)險(xiǎn)較大。對(duì)于抗體研發(fā)企業(yè)來說能否開發(fā)出具有比較優(yōu)勢(shì)的差異化產(chǎn)品至關(guān)重要，這個(gè)差異化主要體現(xiàn)臨床療效的提升和副作用的降低方面，這也就回到了我們第一部分探討的內(nèi)容上。

對(duì)于未成藥的靶標(biāo)而言還可以細(xì)分為兩大類。

（1）一類靶標(biāo)相對(duì)比較成熟，目前有大量的基礎(chǔ)及臨床相關(guān)的研究，有較多的人類循證醫(yī)學(xué)的證據(jù)，目前已經(jīng)有該靶點(diǎn)的抗體進(jìn)入臨床研究，這樣的靶標(biāo)雖然較有上市藥物的成熟靶點(diǎn)的臨床開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)大，但是一旦開發(fā)成功，應(yīng)該具有較大的商業(yè)價(jià)值。

（2）另一類靶標(biāo)就是目前雖然有一些基礎(chǔ)研究，但是臨床和人類循證醫(yī)學(xué)研究很少，目前也沒有進(jìn)入臨床階段的抗體，對(duì)于這樣的靶標(biāo)，臨床開發(fā)風(fēng)險(xiǎn)極高，對(duì)于這樣的靶點(diǎn)很多的時(shí)候還是保持一種跟蹤的態(tài)度，在概念驗(yàn)證上作一些初步工作，對(duì)相關(guān)靶點(diǎn)的研究密切關(guān)注，如有重大突破就可以快速跟進(jìn)。大家可能會(huì)問對(duì)于抗體藥物的全新靶點(diǎn)（還未報(bào)到的靶點(diǎn)）我們是怎么發(fā)現(xiàn)的呢，我們可以通過分子流行病學(xué)調(diào)查，人類遺傳學(xué)研究，人類功能基因組學(xué)、蛋白組學(xué)研究，生物信息學(xué)、藥理學(xué)、模式動(dòng)物研究，人類循證醫(yī)學(xué)研究去發(fā)現(xiàn)。

總之，抗體藥物的開發(fā)必須以臨床需求為核心，解決還未滿足的臨床需求，不斷開發(fā)新的靶點(diǎn)和適應(yīng)癥。對(duì)于初創(chuàng)型的抗體藥物研發(fā)企業(yè)，需要有清晰的自我定位和目標(biāo)，在抗體作用的靶標(biāo)上選擇好，可以兼顧不同類型靶點(diǎn)的一個(gè)搭配組合，確立好了相關(guān)的靶點(diǎn)后就需要在提升抗體藥物功能和療效上下功夫，特別是針對(duì)本文分析的抗體藥物免疫源性及抗體藥物副作用及效應(yīng)功能，通過這些努力以提高抗體藥物的臨床療效，要實(shí)現(xiàn)這些還需要抗體研發(fā)人員對(duì)于抗體藥物的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系有深入的了解，需要抗體研發(fā)企業(yè)有較深的積累沉淀。

為了大家清理理解本文的思路和闡述的邏輯，特配思維導(dǎo)圖一張供大家參考。

參考文獻(xiàn)：

Leipold D, Prabhu S. Pharmacokinetic and pharmacodynamic considerations in the design of therapeutic antibodies.Clin Transl Sci. 2018 Nov 10.

Chan AC Carter PJ. Therapeutic antibodies for autoimmunity and inflammation．Nat Rev Immunol，2010，10( 5) : 301-316．

Weiner L M，Surana R，Wang S．Monoclonal antibodies:Versatile platforms for cancer immunotherapy．Nat Rev Immunol，2010，10( 5) : 317-327．

Kozlowski S, Swann P Current and future issues in the manufacturing and development of monoclonal antibodies.Adv Drug Deliv Rev，2006，58( 5-6) : 707-722．

圖片部分來自網(wǎng)絡(luò)，部分為作者親自畫的，尤其是后面那個(gè)思維導(dǎo)圖，我們獨(dú)家IP，特公開分享給大家。